Teodoro nasceu em Jerusalém, filho de um bispo de mesmo nome, Teodoro, sendo de origem grega — fato que, segundo diversos historiadores, favoreceu sua rápida confirmação pelo exarca bizantino de Ravena, autoridade imperial responsável por ratificar as eleições papais naquele período. Elevado a cardeal-diácono por seu antecessor, o papa João IV, por volta de 641, tornou-se cardeal pleno ainda durante aquele breve pontificado, sendo eleito para sucedê-lo após sua morte. Foi consagrado papa em 24 de novembro de 642, adotando o nome de Teodoro I.

Todo o seu pontificado foi dominado pela intensa e prolongada disputa contra a heresia do monotelismo, doutrina que, apoiada pelo imperador bizantino Heráclio e por seus sucessores, sustentava a existência de uma única vontade em Cristo — posição que a ortodoxia católica considerava incompatível com a doutrina tradicional das duas naturezas e das duas vontades correspondentes, divina e humana, unidas na pessoa de Jesus Cristo. Já no início de seu governo, Teodoro I recusou-se a reconhecer Paulo como legítimo patriarca de Constantinopla, argumentando que a deposição de seu antecessor, Pirro, não havia seguido os devidos trâmites canônicos — posição que expressou em cartas dirigidas tanto ao próprio Paulo quanto aos bispos que o haviam consagrado, exigindo que assegurassem formalmente a legalidade daquela destituição antes que pudesse reconhecer sua ascensão.

O ex-patriarca Pirro, deposto e favorável inicialmente a se reconciliar com Roma, viajou pessoalmente até a cidade para buscar o apoio papal, declarando-se ortodoxo e abjurando temporariamente sua antiga fé monotelita; contudo, ao perceber que Teodoro I não lhe traria de volta sua antiga posição em Constantinopla, retrocedeu em sua abjuração e voltou a se aproximar da capital bizantina e de suas posições monotelitas — episódio que ilustra a complexidade política e teológica que cercava essa controvérsia. Pressionado pelos bispos do norte da África, Teodoro I fez ainda outra tentativa de corrigir Paulo quanto à sua posição doutrinária, mas obteve apenas a confirmação pública de que este de fato professava a crença em uma única vontade em Cristo — o que levou o papa a proferir, em 649, sentença formal de excomunhão e deposição contra o patriarca constantinopolitano.

Paulo reagiu com dura retaliação: ordenou a destruição do altar católico latino que existia no Palácio de Placídia, sede da representação papal em Constantinopla, e mandou exilar ou encarcerar os apocrisiários — os núncios ou representantes diplomáticos do papa junto à corte bizantina. Convenceu ainda o imperador Constante II a emitir um novo decreto imperial, conhecido como o "Typos" (ou "Typus"), que, embora não condenasse explicitamente o monotelismo, do qual o próprio imperador continuava partidário, buscava simplesmente proibir toda e qualquer discussão pública sobre a existência de uma ou duas vontades em Cristo — numa tentativa de silenciar a controvérsia por decreto, sem resolvê-la doutrinariamente.

Diante dessa nova situação, Teodoro I já vinha preparando a convocação de um concílio em Latrão para definir de forma definitiva a doutrina da Igreja sobre essa questão central da fé — sínodo que, contudo, só viria a se realizar já sob seu sucessor, o papa São Martinho I, em 649. Reconhecido por sua caridade para com os pobres de Roma e por seu apoio às igrejas da cidade, Teodoro I faleceu em 14 de maio de 649, sendo sepultado na Basílica de São Pedro.