Alessandro de' Medici nasceu em uma família poderosa e prestigiada de Florença, os Medici. Seu pai era Ottaviano de' Medici, de um ramo colateral, e sua mãe, Francesca Salviati, também pertencia à família Medici e era sobrinha do Papa Leão X.

Após ser ordenado presbítero em 1567, Alessandro iniciou sua vida eclesiástica como pároco de Santo Stefano a Campi e, em seguida, foi nomeado embaixador da família Medici junto ao Papa Pio V, papel que desempenhou na Cúria Romana por muitos anos, com a aprovação mútua dos grão-duques e do papa.

Ele foi nomeado bispo de Pistoia em 1573 e, em 1574, tornou-se arcebispo da sede metropolitana de Florença. Ele delegou parte da administração da arquidiocese de Florença a Monsenhor Alfonso Binnarino, bispo de Camerino. Apesar de sua ausência física, ele acompanhava continuamente sua arquidiocese de Roma. Ele nomeou curas, reorganizou arquivos, estabeleceu vestimentas para o clero e restaurou o Palazzo Arcivescovile, que havia sido gravemente danificado por um incêndio em 1533. Ainda hoje, seu brasão está presente em um canto do palácio, próximo à Via de' Cerretani.

Alessandro foi nomeado cardeal em 1583 pelo Papa Gregório XIII, e somente então fez sua entrada triunfal na cidade. Ele é lembrado como um reformador incansável, promotor de restaurações e embelezamentos em algumas igrejas, sendo um dos arcebispos que mais deixaram sua marca em sua diocese. Ele convocou um sínodo em 1589 e emitiu vários editais.

Posteriormente, ele teve que deixar Florença, pois, em 1596, o Papa Clemente VIII o nomeou legado pontifício em Paris. Lá, ele contribuiu para a reconciliação entre o rei Henrique IV da França, na época casado com Maria de' Medici, e a Igreja Católica, sancionada pelo Edito de Nantes de 1598 e pelo subsequente Tratado de Vervins entre o rei espanhol Filipe II e o rei francês Henrique IV.

No conclave de 1605, após a morte do Papa Clemente VIII, o cardeal Medici foi eleito Papa em 1º de abril de 1605.