Eugênio nasceu em Roma, por volta de 615, filho de um homem chamado Rufiniano, oriundo de família aristocrática romana estabelecida na região do Aventino. Já era um sacerdote de idade avançada e de reconhecido valor moral e intelectual quando assumiu o papado, tendo servido anteriormente como núncio em Constantinopla — experiência que lhe proporcionou profundo conhecimento das intrigas e das artimanhas políticas da corte bizantina, saber que se revelaria fundamental diante dos desafios que enfrentaria à frente da Igreja.

O contexto de sua eleição é indissociável do trágico destino de seu antecessor, o papa Martinho I: em junho de 653, este fora capturado à força em Roma por ordem do imperador Constante II, devido à sua firme oposição ao monotelismo — doutrina que sustentava a existência de uma única vontade em Cristo, contrariando a ortodoxia das duas naturezas e duas vontades. Levado para Constantinopla e mantido em duro exílio, Martinho I jamais retornaria à Cidade Eterna, falecendo em setembro de 655. Diante da ausência de liderança papal efetiva causada por essa perseguição, o clero e o povo de Roma elegeram Eugênio como sucessor em 10 de agosto de 654 — ainda em vida de Martinho I, embora com aparente aquiescência deste, expressa em correspondência que enviara pouco antes de morrer.

Eugênio I revelou-se plenamente à altura das difíceis circunstâncias que herdava: administrou as crises de seu breve pontificado com notável autoridade, mantendo firme a unidade da fé diante das pressões monotelitas vindas de Constantinopla. Enviou representantes para negociar a questão doutrinária com o imperador Constante II, mas quando o patriarca Pedro de Constantinopla respondeu com formulação doutrinária considerada excessivamente vaga sobre as duas vontades de Cristo, o clero e o povo reunidos na Basílica de Santa Maria Maior rejeitaram veementemente o documento, chegando a proibir que o próprio papa iniciasse a celebração da missa até que também ele formalmente o repudiasse — episódio que revela o quanto a questão monotelita mobilizava paixões entre os próprios fiéis romanos. Tal atitude de firmeza doutrinária irritou profundamente o imperador Constante II, que cogitou prender Eugênio I da mesma forma como fizera com Martinho I; apenas uma nova e urgente ameaça representada pelo avanço militar árabe sobre territórios bizantinos o impediu de concretizar essa retaliação.

Popularmente reconhecido como papa benévolo e afável com todos, Eugênio I dedicou-se com especial carinho aos pobres de Roma, chegando a deixar-lhes, ao final da vida, a totalidade de seus bens pessoais como legado de caridade. Comunicou a toda a cristandade europeia o triste fim sofrido por seu antecessor Martinho I, buscando preservar sua memória como mártir da ortodoxia diante da opressão imperial. Ordenou também aos sacerdotes rigorosa observância do celibato e da castidade, e cuidou com particular atenção dos mosteiros franceses.

Faleceu em Roma, em 2 de junho de 657, sendo sepultado na Basílica de São Pedro e posteriormente canonizado pela Igreja, com festa celebrada em 2 de junho — seu breve mas firme pontificado é lembrado como período de necessária estabilização espiritual após os traumas sofridos pela Sé Apostólica sob a perseguição bizantina.